.jpg)
聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction ,PCR)是80年代中期安康起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究 的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研 究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命性创举和里程碑。
PCR技术简史
PCR技术基本原理
PCR反应体系与反应条件
标准的PCR反应体系：
4种dNTP混合物 各200umol/L
模板DNA 0.1～2ug
Taq DNA聚合酶 2.5u
Mg2+ 1.5mmol/L
PCR反应五要素： 参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：
①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右。
②引物扩增跨度： 以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb的片段。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。
dNTP的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5、小量分装， -20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。
模板(靶基因)核酸 模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。 SDS的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀 核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接 用于PCR扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。
Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。
PCR反应条件的选择
PCR反应条件为温度、时间和循环次数。
Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)
复性温度=Tm值-(5～10℃)
在Tm值允许范围内， 选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。
③延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：
70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子
70℃ 60核苷酸/S/酶分子
55℃ 24核苷酸/S/酶分子
高于90℃时， DNA合成几乎不能进行。
PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够 的。3～4kb的靶序列需3～4min；扩增10Kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。
循环次数 循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度。一般的循环次数选在30～40次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。
PCR反应特点
特异性强 PCR反应的特异性决定因素为：
①引物与模板DNA特异正确的结合；
②碱基配对原则；
③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；
④靶基因的特异性与保守性。
其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。
简便、快速 PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。
对标本的纯度要求低 不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。 PCR扩增产物分析
PCR产物是否为特异性扩增 ，其结果是否准确可靠，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。
凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预讦的大小，这是起码条件。
琼脂糖凝胶电泳： 通常应用1～2%的琼脂糖凝胶，供检测用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳：6～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。
酶切分析：根据PCR产物中限制性内切酶的位点，用相应的酶切、电泳分离后，获得符合理论的片段，此法既能进行产物的鉴定，又能对靶基因分型，还能进行变异性研究。
分子杂交：分子杂交是检测PCR产物特异性的有力证据，也是检测PCR 产物碱基突变的有效方法。
Southern印迹杂交： 在两引物之间另合成一条寡核苷酸链(内部寡核苷酸)标记后做探针，与PCR产物杂交。此法既可作特异性鉴定，又可以提高检测PCR产物的灵敏度，还可知其分子量及条带形状，主要用于科研。
斑点杂交： 将PCR产物点在硝酸纤维素膜或尼膜薄膜上，再用内部寡核苷酸探针杂交，观察有无着色斑点，主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。
先问清当地户籍部门，是否有指定机构，一般情况下被鉴定人要到指定的鉴定机构进行亲子鉴定。
由工作人员现场核实身份并拍照取样;
亲子鉴定上户鉴定规定
因孩子被拐卖、遗失，后又通过各种途径找回，DNA需要和亲生父母上到一起，而需要亲子鉴定报告书证明。
弃儿回家上户。孩子被抱养出去，又需领养回来，或因躲避计划生育，孩子DNA上在他人名下需要转到亲生父母名下，需要做亲子鉴定。
部门特殊规定，因某些部门在招工、招干时，因怕其他行业人员进入特殊行业，在招工招干时需要本行业父母和孩子做亲子关系证明。如郑州铁系统招工就需要亲子鉴定证明。
领养的孩子上户，需要证明孩子与养父母并非亲生关系。
上户亲子鉴定所需要的手续：上户亲子鉴定属于上户关系人自行举证过程，因而鉴定证明仅需鉴定当事人提供：
能够证明被鉴定人身份的证明：如身份证、DNA本、军人身份证明、等。无以上证明者就需要乡镇以上安康、街道办、公安派出所申请鉴定证明。
被鉴定者半年内输过他人的血，或在两年内进行过骨髓移殖，无法得出准确的结论。需要鉴定者应该避过以上时间。
亲子鉴定的用途是非常广泛的，遗产的纠纷、强奸罪名的认定以及各方面的纠纷都可能会涉及到亲子鉴定的内容，通过亲子鉴定就能够得知具体的关系，像用头发亲子鉴定可以吗这样的问题，只要毛囊发育完全后就可以采用头发进行鉴定，一般情况下12岁后的孩童毛囊就已经发育完全。
《民法典》
早孕试纸的问世给诊断早孕带来了很大的便利。女性怀孕的第七天，尿液中就能测出一种特异性的激素-人无创亲子鉴定膜促性腺激素，它的作用是有利于维持妊娠。基础体温测定。每天早晨醒后卧床测量体温，这时的体温称为基础体温。一般排卵前体温在36.5℃以下，排卵后孕激素升高，作用于体温中枢，使体温上升0.3-0.5℃。如卵子未能受精，则约一周后孕激素下降，体温恢复正常;若已妊娠，则孕激素保持高水平不变，使体温亦保持高水平。
原理：DNA亲子鉴定就是利用医学、生物学和遗传学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或生理机能方面的相似特点，分析遗传特征，判断父母与子女之间是否是亲生关系。
一、血痕样本采集方法：
1、采血前提前准备好酒精棉球，采血针，医用消毒纱布，纸质信封。
2、采血时先用酒精棉球消毒采血部位，并消毒采血针，取五滴拇指盖大小血，滴于医用纱布上。
3、大人和小孩的血分别滴于不同的纱布上，并做好标记（父母子等字样）记录采集日期。
注意事项：
1、血痕可以取耳缘血或指尖血，婴儿可以采集足跟血。
2、血痕要在桌面上自然阴干，不能加热或在太阳下暴晒。
3、不同人的血样不能互相接触，放入不同的牛皮纸信封中，信封上标记清楚。
二、指甲采集方法
采样方法：
1、样本采集前，提供样本者需先清除每个指甲内的污垢（可用牙签等）然后用清水洗净双手并用一次性纸巾或者一次性纱布擦干双手；
2、采样人员采样前也要将双手洗净并带上手套；
3、使用指甲钳或者剪刀（每次使用前要用清水清洗或者酒精消毒，以免残留前者的DNA物质）将指甲游离边缘减掉，然后放在事前准备好的白纸上；
4、剪指甲时越靠近里面（靠近手指肉）剪越好，剪好后用干净的白纸包好（不可使用朔料袋密封），至少要3个以上指甲;
注意事项:
1、采集样本时不能被提供样本以外的人皮肤直接触碰到指甲；
2、自然阴干后再装入纸质信封，请勿用保鲜膜或塑料袋包装，以免霉变影响检测质量；
三、烟头的采集方法和要求
1、将鉴定人吸食过的烟蒂（烟灰去掉干净后）采集2-3个；
2、采集后将烟蒂装入纸质的信封袋中（不可使用朔料袋密封），并做好标记。
注意事项：
1、 确定所采集的烟蒂均为安安康定人吸食过的；
2、 采集样本时尽量避免碰到烟蒂吸食的部分；
3、 样本提取完成后请尽快送(邮寄)到本鉴定中心，避免因环境因素使DNA降解,影响检测结果。
四、无创亲子鉴定样本提取
五、口腔采样
注意：避免用手触及口腔棉签。所有测试人员请先用清水漱口，孩子在喝奶的情况下，请隔1个小时后再进行口腔取样；
收集样本的基本卫生条件：清洁的双手，新的口腔棉签（药店出售的单头棉签）、干净的信封。
1、先在干净的纸质信封上做好标记，标记样本采集日期、样本身份如：父亲、母亲、孩子等及姓名或代。
2、用棉签伸到孩子口腔内，棉签头轻刮取口腔内两侧（内颊、腮帮子处）及舌下处，可轻轻的旋转或刮动10次左右后再取出，重复取3-5根即可。
注意：在采集过程中请不要用手触及口腔棉签的棉球部分，请稍用力旋转并刷动以保证获得足够的DNA。
采集完成后，可直接用透气纸质信封包装（透气信封会自然阴干）。（不能用塑料袋因为不透气会引起样本发霉或发臭，降解DNA，影响实验，除非一些特殊样本需要冰箱保存，日常样本用透气信封包装即可）
注意：请不要弄错样本，请保证样本与包装信封上所标记的人一致。
口腔拭子样本注意事项：
避免用手触及棉签头，采集前请先用清水漱口。上述方法采集的样本，可以在干燥环境下保存2—3个月。
口腔拭子需应阴干后装入纸质信封中，以免口腔拭子发生霉变影响检测;
不同人的口腔拭子需要单独存放并做好身份标识。
口腔试子样本采集方法优点：无痛、便捷。
六、毛发采集
注意事项：避免用手触及样本的毛囊！
基本卫生条件：清洁的双手，洁净信封。
先在干净的信封上作好标记，标记样本采集日期、样本身份如：父亲、孩子的名字。
从头发、睫毛、腋毛等处，拔下至少5根毛发（毛发末端用肉眼可见清晰的毛囊）。
注意：采集过程中不要用手触及毛发的毛囊部，确认能在毛发末端用肉眼可看见清晰的毛囊。
将刚拔下的毛发立刻放入已做好标记的信封内。需检查毛发是否有清晰可见的毛囊。
注意：请不要用手触及毛发的毛囊部分。请不要装入落在地上的样本，和拔下已经很久的样本。请不要弄错样本，请保证样本与塑料袋上所标记的人身份一致。
上一篇：孕期亲子鉴定的方法
下一篇：快速准确的亲子鉴定方法是
.png)
一直担心孩子不是自己亲生的，想要做亲子鉴定，但是又不能让媳妇知道，这样会影响家庭和睦。通过了解后得知可以在安康生物亲子鉴定中心做隐私亲子鉴定，这样既可以得到自己想要的结果，又可以保护自己的隐私，很感谢安康生物让我知道孩子是自己的！
.png)
偷偷的拿着孩子的头发做隐私亲子鉴定，真是心惊胆战，生怕多一个人知道，还好安康生物亲子鉴定中心的保密工作做的非常好，没有一个熟人知道我做了亲子鉴定，谢谢！
.png)
必须好评，偷偷的拿着用头发做隐私亲子鉴定，几天就通知我结果，报告正规，非常感谢安康生物亲子鉴定中心工作人员的帮忙，让我更珍惜我的老婆和孩子。
.png)
安康生物亲子鉴定中心的隐蔽性很好，结果也准确，家庭风波已过，感谢这里的工作人员。
.png)
安康生物亲子鉴定中做的隐私亲子鉴定出报告还是非常快的，才几天就拿到结果了，效率很高。
.png)
通过做隐私亲子鉴定测完后，确认儿子是亲生的，拿到报告后很开心，工作人员王波挺靠谱，帮我保密工作做得很好。
正规资质
报告真实
准确快速
保密承诺
热门文章热门地区
沪ICP备18014489号-2 24小时免费服务热线：400-025-1120
地址：上海市浦东新区浦建路145号强生大厦
400-025-1120
